在丝状支架上喷墨打印自组装肽以进行神经元细胞的图像化处理-技术前沿-资讯-生物在线

在丝状支架上喷墨打印自组装肽以进行神经元细胞的图像化处理

作者：上海睿度光电科技有限公司 2021-07-28T00:00 (访问量:8322)

喷墨打印是一种有效的支架成型方法，该技术在神经组织工程精密支架的制备中具有很大的应用前景。周围神经损伤占世界创伤损伤的2.8%，主要是挤压、穿刺、牵引、电击和振动损伤，这些伤害影响到全世界数以百万计的人，导致人们的预期寿命缩短并增加社会和经济负担。虽然受伤的神经有再生的能力，但需要外部治疗干预以确保适当的愈合，因此，用于引导神经细胞附着、排列和增殖的工程神经支架的研制受到了极大的关注。英国谢菲尔德大学化学与生物工程系招秀伯教授课题组，利用一种自组装肽作为细胞吸引剂，并以再生丝素（RSF）作为排斥剂，利用Inkjet喷墨打印技术对神经元PC12细胞进行图形化处理，来指导神经元细胞的生长。

制造支架来引导神经元细胞的生长是一个挑战，细胞图像化处理是一项重要的技术，它能帮助研究人员准确地将细胞群定位到基底上的指定区域，并促进复杂生物系统的设计，以研究细胞行为如细胞排列、细胞间相互作用、细胞与环境相互作用及药物筛选等应用。因此，一种能够快速制造有图案的支架/底物的技术是必不可少的。谢菲尔德大学招秀伯教授课题组在“Patterning the neuronal cells via inkjet printing of self-assembled peptides on silk scaffolds”（发表于《Progress In Natural Science：materials International》）的研究中，采用自组装I₃QGK肽纳米纤维通过旋转涂层和喷墨打印的方法将其覆在带负电荷的RSF膜上以引导细胞附着，然后将大鼠嗜铬细胞瘤神经元（PC12）细胞作为神经元分化和神经突起形成的体外模型，研究了图案化表面上PC12细胞的细胞附着、活力和表型。

实验材料主要为家蚕茧（西南大学）、合成肽AC-I₃QGK-NH₂（GL Biochem）、PC12神经元细胞来源于HPA培养物及其他化学试剂。蚕茧通过洗涤、煮沸冲洗流程后去除丝胶，将脱胶后的丝素在60℃的烘箱中干燥2天后进行透析并离心得到RSF，将处理后的合成肽以及RSF通过旋涂设备涂覆在干净的玻片上，使用MicroFab Jetlab 4 XL系列喷墨打印设备，以90V、300Hz的电压参数喷墨打印直线及谢菲尔德大学标志，打印后进行细胞培养。

▲ 图1 通过旋涂和喷墨打印在RSF基板上制造微图案，以及在图案表面附着细胞

经过细胞计数、染色实验及数据统计等测试步骤，可以得出，支架的表面形貌对细胞粘附有显著影响，为了建立支架表面形貌和细胞附着之间的关系，使用原子力显微镜来表征RSF/I₃QGK的形貌，如图2。

▲ 图2 不同表面及RSF/I3QGK比例的AFM图像

并且，研究表面细胞活性也与表面形貌以及RSF/I₃QGK比例有关，如图三所示，总体来说，随着I₃QGK浓度的增加，附着在表面的细胞数量也会增大，但是当I₃QGK浓度增加到5mg/ml时，细胞数量略有减少（图3g），部分区域无细胞附着，这可能是由于当使用高浓度的肽溶液进行表面涂层时，堆叠的纳米纤维脱离（图2g），这意味着生物力学因素也起着重要作用，当表面有更多的肽纤维时，一些肽纤维在染色后的缓冲洗液中会发生黏结松散和脱落。由此可以假定RSF/I₃QGK为神经元细胞的附着和增值提供了一个很好的解决方案，最好的涂层I₃QGK浓度约为3-4mg/ml。

▲ 图3 不同表面及RSF/I3QGK比例的细胞活性

神经元细胞对齐在轴突再生中起着至关重要的作用，是神经组织工程的一个关键方面，Inkjet打印是一种新兴的技术，可以以非接触方式用于生物材料的微观图案制备，因此本研究中被用于在RSF涂层基底上绘制肽纳米纤维图案，如谢菲尔德大学的标志（图4），随着打印层数的增加，附着的细胞数量也会增加，说明PC12细胞在RSF/I₃QGK上的增值与附着取决于附在表面的纳米肽纤维的数量，细胞的排列在细胞分化、细胞微环境和细胞与细胞相互作用中起着主导地位。

▲ 图4 通过Inkjet制备肽纳米的纤维谢菲尔德大学校徽

综上所述，合成肽I₃QGK可以动态地自组装成纳米纤维，通过电荷作用将其涂覆或打印到RSF支架上，改善神经元细胞的附着和分化以及神经突的生长。此外RSF/I₃QGK对PC12神经元细胞具有较低的细胞毒性，喷墨打印能够将功能性肽纳米纤维墨水沉积成复杂的图案，并促进组织工程应用中的细胞排列，为进一步分析体外细胞功能（如轴突发育）提供了一种方法。

参考文献：

[1] Sun W , Zhang Y , Gregory D A , et al. Patterning the neuronal cells via inkjet printing of self-assembled peptides on silk scaffolds[J]. Progress in Natural Science, 2020, 30(5).

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