回顾了一下以前被咨询到的问题，发现被各位老师问到最多的一个就是载体带什么荧光比较好，或者要不要带荧光，荧光是不是一定要带，该怎么带，又该如何去选择荧光。光是想想，就成了一个繁琐又让人头大的问题，今天我们就来捋一捋，看如何在色彩斑斓的荧光中挑到属于自己的那款。

图1：市场上常用荧光蛋白展示^【1】

1.  什么荧光比较好？

回答这个问题，我们需要转换一下角度，与其是选择最hao的荧光，不如说是选择合适自己实验体系的荧光。举个例子，在细胞感染病毒或者转染质粒之后下一步要面对的就是细胞学实验，在林林总总的细胞学实验中，有这样一类实验叫做凋亡检测，而检测结果目前文章最首肯的是双荧光检测的结果，很不巧这里的FITC荧光信号，凋亡前期使用的是绿色荧光，后期使用的是红色荧光。如果我们的细胞中携带红色或者绿色荧光，那么对于我们凋亡检测而言是会有具大的干扰。那我就不能带荧光了嘛？也不是这样，如果可以避开红光，绿光或者其他波长相近的荧光蛋白，选择其他波长差异较大的，也是可以使用的。

图2：细胞凋亡检测Annexin V-FITC/PI 染色结果^【2】

2.荧光是融合还是非融合，这两者有什么差异？

对于这个问题，我们先讨论一下两者使用的场景，首先什么时候需要融合荧光？荧光的常规用途是什么呢，方便告知我们细胞中有没有被载体成功转染，毕竟只有成功转染载体的细胞才有荧光嘛，展开一下，同样的道理，如果蛋白上融合了荧光蛋白，那么是不是只有这个蛋白才会被荧光示踪，蛋白在哪它在哪，两者执子之手，与子共生，蛋白多荧光就亮，蛋白少荧光就暗淡。这里就是融合荧光蛋白的两个主要作用，观察蛋白定位以及对表达量做相对定量，如果做了调控，可以从荧光强度的相对变化判断其趋势。

图3：线粒体定位信号偶联GFP标记线粒体(吉凯载体)^【3】

那什么是非融合呢？就是各做各的，蛋白独立表达，荧光蛋白岁月静好，不会因为其中一者被影响连带另一个也被影响，自然这种情况下就没有办法像融合荧光一样看定位，看表达量变化趋势。

图4：携带荧光的慢病毒感染细胞观察荧光效果(吉凯载体)

3.那些场景下使用哪些荧光蛋白？

1.转染/感染后观察荧光：常规选择EGFP/mCherry这类荧光蛋白，但不绝对，需要结合后续的实验选择具体的荧光蛋白标签。提供一个各类荧光蛋白以及波长的链接供各位老师细细挑选(https://doi.org/10.1002/0471143030.cb2105s36)或者联系相关工作人员获取文献。

2.活体成像类实验：常规选择萤火虫荧光素酶Fluc(Firefly luciferase)，通过和荧光素钠盐或者钾盐这类底物在ATP的供能下产生荧光，并不需要被激发，极大减少了背景底噪带来的影响，同时因为较大的波长，被肌体吸收的情况较荧光蛋白好很多，提高成像的效果。

图5：FLUC细胞注射后活体成像分析调控带来的影响(吉凯慢病毒)^【4】

备选通常是海肾荧光素酶Rluc(Renilla Luciferase)，该酶可以氧化腔肠素产生能量并在此过程中产生荧光，和萤火虫荧光素酶不同的是，该体系不需要ATP的参与，但是因为低于Fluc的波长，且相对靠近肌体的吸收波长，同时特异性要差一些，成像效果上不如Fluc。

图6：伴随小鼠生长脑中肿瘤海肾荧光信号值产生的变化^【5】

EGFP或者mcherry这样的可以吗？可以，当然也可以，但是只能做体表或者眼球这样的浅层成像，我们一直强调肌体是可以吸收蓝绿光波段的波长，很不凑巧EGFP是绿光，如果在体内，提别是深层脏器，损失就更大，所以深层脏器就不要使用这类荧光蛋白了。那有老师会说红光呢？是个不错的选择，但是很多激发波长也是在红绿波段，整体不是很好，不过iRFP713这类的红外荧光蛋白倒是可以获得豁免，他们的激发和发射光都是在红外波段，做成像也是可以的。

图7：不同IRFP蛋白动物成像强度比较^【6】

3.互作类实验：在讨论这个之前，我们先不讨论用什么荧光合适，研究互作往往会用到很多实验，其中用到荧光的实验主要有两类，双分子荧光互补实验(BIFC)或者能量共振转移荧光实验(FRET/BRET)，BIFC是将一个荧光蛋白分成两部分，分别构建在需要研究的两个蛋白上，当两个蛋白结合时，分为两半的荧光蛋白得以接近，并且形成一个整体被荧光激发释放出荧光。

图8：A1阴性对照组未观察到荧光信号，阳性对照组可见强信号，与 pHA-Tf2b 和 pFlag-Tuba1α 质粒共转染的细胞显示荧光信号，这表明 TFIIB 和 α-微管蛋白直接相互作用^【7】

这种方式存在一些缺点，比如对于温度比较敏感或者结合需要的时间比较长，并不能实时观测结合情况。那么我们就把目光换到FRET上，相较于前者把一个蛋白分成两个，这种则是使用两种不同荧光的蛋白，分别构建至两个需要研究的蛋白上，然后两者会结合？不不不，这里用到的是另一个原理，在荧光蛋白距离足够接近时，A荧光蛋白的发射光如果在B蛋白的吸收或者说激发波长内，则荧光不发射，而是通过共振的方式传递给B蛋白，这样就可以通过荧光的变化判断两个蛋白之间有没有结合。

图9：通过活细胞中的敏化发射对FRET进行成像，用 GFP2 和 YFP （A^D） 或

GFP2^YFP 串联构建体并在室温下 16 小时成像^【8】

嗯，但是这个方法也不是十全十美的，也是有一些缺点的，比如细胞本身荧光底噪的问题，那解决方案是什么，回忆之前活体成像环节提到的荧光素酶，这类蛋白可以在不被激发的情况下通过酶促底物反应产生光，这个前提下以荧光素酶作为荧光供体，常规荧光蛋白作为受体，就可以通过荧光观察是否有互作了。然而，虽然说这两者都可以研究结合，但是只要距离够近哪怕是不结合也是可以发出需要检测的荧光的，所以一定记得需要设置对照组哦。

图10：由REV磷酸化诱导的构象改变增加了Rluc8和Venus之间的距离，促进了BRET的增加^【9】

4.一些特殊实验对于荧光蛋白的要求：没错，常规实验就是对荧光蛋白类型的要求，对于本本身理化性质要求不大，但是一些特殊的实验却需要特别考虑这一些问题。比如在对缺氧环境下进行荧光标记，或者通过荧光强度反应缺氧条件下一些基因被调控的情况时，常规的EGFP就变的不是那么合适，因为在缺氧的情况下常规的绿色荧光蛋白成熟会被影响，导致无法正常发挥功能，那替换的荧光应该选什么呢，选择UnaG，该蛋白也是绿色荧光，同时可以在低氧的情况下成熟发光，且稳定性也满足实验要求。

图11：低氧诱导因子激活系统检测示意图^【10】

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参考文献…

1. A guide to choosing fluorescent proteins

2.Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling

3.Endophilin B2 promotes inner mitochondrial membrane degradation by forming heterodimers with Endophilin B1 during mitophagy

4. Noninvasive Visualization of MicroRNA-16 in the Chemoresistance of Gastric Cancer Using a Dual Reporter Gene Imaging System

5. In Vivo Testing of Renilla Luciferase Substrate Analogs in an Orthotopic Murine Model of Human Glioblastoma

6. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging

7. TFIIB Co-Localizes and Interacts with α-Tubulin during Oocyte Meiosis in the Mouse and Depletion of TFIIB Causes Arrest of Subsequent Embryo Development

8. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2–YFP FRET pair

9. REV, a BRET-based sensor of ERK activity

10. Hypoxic niches attract and sequester tumor-associated macrophages and cytotoxic T cells and reprogram them for immunosuppression