Activity-Based Protein Profiling（ABPP）实验流程涉及从探针设计、样本处理，到信号检测和数据分析的多个关键步骤。以下是标准ABPP实验流程及每一步的操作要点，适用于大多数酶类研究（如丝氨酸酯酶、蛋白酶、脱酰化酶等）。

一、ABPP实验流程概览

1、活性探针准备

2、样品制备（细胞、组织或纯化酶）

3、探针标记（incubation）

4、富集或分离（可选）

5、分析检测（SDS-PAGE/Western blot 或 LC-MS/MS）

6、数据分析（定性或定量）

二、各步骤详解与操作要点

1、活性探针设计与准备

（1）组成结构：

• Warhead：选择能与靶酶活性位点共价结合的反应基团（如氟磷酸酯、氯甲基酮等）。
• Linker：可调控空间构象，避免干扰酶识别。
• Reporter Tag：可为荧光基团、生物素、放射性标签，或“click chemistry”接头（如alkyne）。

（2）操作要点：

• 根据靶酶催化机制设计反应基团。
• 若用于LC-MS，推荐使用小分子标签或“click”探针，便于后续纯化和检测。

2、样品制备

（1）类型：

细胞裂解液、组织匀浆、血清、纯化酶、活细胞、动物组织等。

（2）操作要点：

• 保持酶活性：裂解液中需含适当缓冲液（常用PBS、Tris-HCl），避免强变性剂和高浓度去污剂。
• 预清洗：清除背景干扰蛋白。
• 保持冷链：使用低温（0–4°C）制备，加入蛋白酶抑制剂（避开靶酶类抑制剂）。

3、探针标记（Incubation）

（1）条件优化：

• 探针浓度：通常在 0.1–10 μM 范围。
• 时间：10–60分钟。
• 温度：常为 37°C，部分细胞实验可在 室温或4°C 进行以降低非特异性标记。

（2）操作要点：

• 可设对照组：如未处理、热灭活样本或加入已知酶抑制剂。
• 竞争性ABPP：加入小分子抑制剂预处理样品，检测其是否能竞争性阻断探针结合。

4、富集（可选）

适用于非荧光标签，如带有生物素/alkyne的探针，需点击反应和亲和纯化。

（1）操作：

• Click Chemistry：alkyne + azide-Cy5/biotin，在Cu(I)催化下点击。
• 富集方式：链霉亲和素磁珠拉下（biotin-labeled probe）。

（2）要点：

• 反应缓冲液需氧化还原控制良好。
• 使用磁珠洗脱样本时注意避免非特异性结合。

5、分析检测

要点：

（1）蛋白定量应准确，确保每组样品上样量一致。

（2）对质谱样品应酶解、脱盐、纯化后上机。

6、数据分析

依据实验类型：

（1）定性：酶种类识别、蛋白识别率（如ABPP-MS）。

（2）定量：通过同位素标记（SILAC、TMT）、标签自由（LFQ）等方法评估酶活性变化。

（3）图像分析：荧光凝胶可用 ImageJ 进行条带强度分析。

三、关键操作注意事项总结

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）将化学探针与蛋白质组学相结合，能够在复杂生物样本中特异性检测活性酶，揭示其功能状态和调控机制。通过合理设计活性探针、优化样本处理与标记条件，并结合高效的检测手段（如荧光成像或质谱分析），ABPP不仅可用于酶功能研究和药物靶点鉴定，也在疾病机制探索和临床标志物发现中展现出巨大潜力。掌握其实验流程与关键操作要点，将为深入开展功能蛋白质组学研究提供坚实基础。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

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单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

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①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

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百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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