鸟枪法蛋白质组学（Shotgun Proteomics）是当前蛋白质组研究中应用最广泛的策略之一。它通过将复杂蛋白混合物酶解成肽段，并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）实现大规模蛋白质鉴定与定量，广泛用于疾病机制解析、生物标志物筛选及功能蛋白研究。本文系统梳理鸟枪蛋白质组学从样本处理到数据解析的全流程，帮助科研人员理解各关键环节的技术要点与优化策略。

一、样本制备：确保下游分析的起点准确

1、蛋白提取

不同样本类型（如组织、细胞、体液）需采用定制化裂解方案，常见裂解方法包括RIPA缓冲液、尿素/硫脲体系或SDS裂解液，需兼顾蛋白回收率与变性效率。样本操作全程应低温进行，以防蛋白降解或修饰干扰后续分析。

2、蛋白定量与质控

采用BCA或Bradford方法对总蛋白浓度进行准确测定，确保各样本加载量一致。SDS-PAGE可作为质控手段，评估蛋白完整性与降解情况，是构建高质量数据的前提。

二、蛋白酶解：生成质谱可检测肽段

鸟枪法分析的核心是肽段而非整蛋白。高效、标准化的酶解策略对于保证重复性与定量准确性至关重要。

1、还原与烷基化

利用DTT或TCEP等还原剂破坏蛋白二硫键，随后使用碘乙酰胺（IAA）进行烷基化，封闭巯基，防止重构二硫键，提高酶解一致性。

2、胰酶酶解

胰酶（Trypsin）为最常用的酶解工具，推荐的酶与蛋白质量比为1:50至1:100（w/w）。在37°C条件下孵育12~16小时 可实现较为充分的酶解。需确保pH、温度与离子强度适配，以实现肽段生成的最大化。

三、肽段纯化与分级：降低复杂度提升鉴定深度

1、固相萃取（SPE）

SPE用于去除盐离子、脂质及干扰物质，并富集有效肽段。未纯化肽段可能导致质谱抑制效应，影响峰识别与定量稳定性。

2、分级策略

为提升蛋白覆盖率与鉴定通量，可采用高pH反相分级、强阳离子交换（SCX）或电泳分离技术，将复杂肽混合物按理化性质预先分层，显著提升数据质量，尤其在复杂组织样本中效果显著。

四、LC-MS/MS分析：高分辨率检测肽段特征

1、液相色谱分离

纳升流液相色谱（nanoLC）结合C18色谱柱实现高分辨分离，通过优化梯度洗脱时间与缓冲液体系，有效提升肽段峰形与重现性。

2、串联质谱扫描

采用数据依赖采集（DDA）或数据独立采集（DIA）模式获取MS/MS谱图：

• DDA适合深度鉴定研究，依赖实时选择最强信号肽进行碎裂；
• DIA可覆盖更多低丰度肽段，适用于大样本定量与临床队列分析。

高分辨质谱仪的使用显著提升肽段鉴定准确性与定量动态范围。

五、数据分析：从原始谱图到蛋白鉴定与定量

1、肽段谱图匹配

使用搜索引擎将MS/MS谱图与理论肽段数据库进行比对，FDR控制（通常设定在1%）确保结果可靠。数据库选取需与物种及样本背景一致。

2、蛋白推断

多个肽段映射到同一蛋白以确认其存在，需注意共享肽段的归属策略。常见算法包含最大似然法、概率模型或分数加权系统。

3、定量方法选择

• 标签法（如TMT、iTRAQ）适合多样本定量，批间差小；
• Label-free定量则无需额外标记，适合探索性研究；
• DIA定量依赖谱库构建与算法模型，可实现高重复性与灵敏度。

六、生物信息学分析：赋予数据生物学意义

定量结果本身并不能揭示机制，需结合系统性数据挖掘与功能注释完成深入解析。

1、差异蛋白筛选

通过统计学方法（如t检验、ANOVA）筛选显著变化蛋白，结合火山图、主成分分析（PCA）等方式进行数据降维与可视化。

2、功能富集分析

GO（Gene Ontology）与KEGG通路富集揭示差异蛋白所涉及的生物过程、分子功能与信号通路，是理解调控机制的重要手段。

3、蛋白互作网络构建

构建PPI网络可揭示核心调控蛋白与功能模块，结合网络拓扑分析可进一步挖掘潜在靶点或关键节点，为后续实验验证提供依据。

鸟枪蛋白质组学技术以其高通量、广覆盖和良好的可扩展性，成为生命科学研究中不可替代的研究工具。全面掌握其实验与分析流程，有助于提升研究效率与成果质量。百泰派克生物科技构建了覆盖样本处理—肽段检测—数据解析—生物学解读的闭环式服务流程，为科研客户提供高标准、一体化的技术解决方案。如您有相关项目需求，欢迎联系我们，获取定制化技术建议与服务方案！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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