Millipore引领蛋白质研究领域的创新潮

自从1979年，Towbin发明Western blotting以来，Western blotting已经成为实验室研究的一种常规工具，它一般用于检测复杂样品中的少量蛋白质或监测蛋白质的表达和纯化。Western blotting的过程包括用凝胶电泳分离蛋白质混合物，随后电转移到适当的膜上，再通过与标记抗体或抗原的反应，最后鉴定特定的蛋白质。

虽然Western blotting技术已经非常成熟，但人们对此项技术仍进行着不断的改进。在蛋白质样品制备方面，从简单的细胞裂解到使用超滤装置（如Millipore的Microcon和Amicon）对蛋白样品进行浓缩和纯化，极大地提高了样品的质量，使得Western blotting检测的范围更加扩大。蛋白质转移膜也从最初的硝酸纤维素膜进化到具有更强吸附力的PVDF膜，进而发展到今天的具有各种特殊用途的专业PVDF膜（如Millipore专为分析小分子蛋白设计的Immobilon-P^SQ和专为荧光显色设计的Immobilon-FL等）。在抗体杂交方法上，除了传统的抗体杂交方法外，随着Millipore第一张PVDF膜的诞生，快速抗体杂交法也随之诞生了，此种方法省去了封闭处理，加快了抗体杂交的速度。但Millipore的科学家们并不就此满足，2008年Millipore又推出了SNAP i.d.抗体杂交加速器，它彻底改变了抗体杂交的原理，将抗体杂交的时间从4到20个小时减少为30分钟。此外，在Western的检测手段上技术也不断提高，高灵敏度的化学显色底物已经代替了低灵敏度的化学显色底物，其灵敏度已经达到了飞克级（如Millipore的Immobilon^TM Western HRP底物）。

这一切都使得今天的Western blotting变得更快，更好，更简单，下面将给大家介绍一些最近的新产品。

1.        半小时完成抗体杂交！―SNAP i.d. 抗体杂交加速器

图1：SNAP i.d.抗体杂交加速器

SNAP i.d.抗体杂交加速器由主体，托盘，和抗体收集盘三部分组成。托盘又分为单个托盘，双联托盘和三联托盘，可同时进行1到3片膜的操作。主体可以容纳两个托盘，所以每个SNAP i.d.最多可以同时检测6张膜。

传统的Western blotting抗体杂交法是依靠被动地分子扩散来达到封闭膜，一抗识别抗原，二抗识别一抗，以及去除非特异性结合等目的。此过程缓慢且受到溶液与膜的接触程度，溶液体积，孵育时间，孵育温度，封闭剂溶解程度等诸多因素的影响，导致Western blotting结果重复性不好，而且对于低丰度蛋白的检出灵敏度不佳。Millipore的SNAP i.d.创新性地使用了真空抽滤的方法，使得封闭剂，抗体溶液和洗脱液主动地通过膜，并与膜上的蛋白发生反应。此种方法具有以下优点（见表1）：

l        节约时间：通过真空抽滤的方法，使封闭，抗体孵育以及洗脱全过程从传统的4小时甚至两天缩短到30分钟。

l        保证检测的灵敏度：由于抗原抗体的主动接触，且抗体溶液均匀穿透整张膜，使得抗体有机会充分地接触到膜内的蛋白质，提高了抗原抗体结合的成功率，保证检测灵敏度。

l        降低杂交背景：

n        由于抗体与膜的接触时间被缩短，极大地降低了抗体与膜的非特异性结合。

n        通过真空抽滤的方法使得洗脱过程更为彻底，克服了传统洗脱方法的低效率。

n        封闭剂与膜主动全方位的接触，封闭时间由一个小时降低到20秒，提高了封闭的效率，同时封闭剂浓度由5%的脱脂牛奶降低到0.5%的脱脂牛奶，大大地降低了脱脂牛奶因不能完全溶解而造成的高背景，以及可能发生的过度封闭等问题。

l        延长抗体寿命：对于抗体而言，SNAP i.d.极大地降低了抗体暴露在室温中的时间，延长了抗体的寿命，增加了抗体重复使用的机会。

l        高兼容性：既可以与上游各种蛋白转移膜包括各种PVDF膜和NC膜兼容，也可以和下游各种化学或荧光检测方法兼容。

表1：SNAP i.d.与传统抗体杂交法的比较

基于SNAP i.d.抗体杂交加速器的以上优点，该技术为各种表达丰度和各种分子量大小的蛋白质检测提供了一个快速，灵敏，方便，可靠的解决方案。SNAP i.d.还适用于快速优化抗体的浓度，大大减少了摸索实验条件所花费的时间，提高了工作的效率和实验的成功率，是优化抗体浓度的最佳选择。

2.极低荧光背景的PVDF膜―Immobilon^TM-FL

蛋白转印膜是Western blotting的核心。作为转印膜技术的鼻祖，Millipore一直引领着实验室转印膜技术的发展。继1975年E. M. Southern用Millipore的硝酸纤维素膜发明Southern blotting技术后，1979年H. Towbin用Millipore的硝酸纤维素膜进行了世界上第一次Western blotting实验，从此开创了Western blotting技术。1985年Millipore为了进一步提高Western blotting技术，发明了0.45μm 的PVDF膜Immobilon^TM-P，它打破了硝酸纤维素（NC）膜一统天下的局面。PVDF膜以其优良的机械性能，超强的吸附能力，逐渐取代了NC膜，成为Western blotting的首选（详见表2）。

1988年Millipore发明了专用于检测小分子蛋白质的0.2μm PVDF膜Immobilon^TM-P^SQ。 Immobilon^TM-PSQ以其紧密的孔隙结构和高内表面积，能够吸附100%的蛋白质，特别是对小于20KDa的蛋白质具有超强的结合力，适用于全部蛋白分析，小分子蛋白质的免疫检测，氨基酸分析，和N-端蛋白质测序等。另外，Immobilon^TM-P^SQ转印膜不含污染性支撑物或表面活性剂，故在层析谱上的背景峰值极小，适用于直接从膜上回收蛋白质进行质谱分析。

表2：PVDF膜与醋酸纤维素膜(NC)膜的比较

Millipore最新推出的Immobilon^TM-FL是第一个专门为荧光显色设计的转移膜。它除具有PVDF膜的所有优点外，其荧光背景还比一般的PVDF膜低10倍，比NC膜低2倍，进而提高了荧光检测的灵敏度（见图2）。此外，Immobilon^TM-FL与所有常用的荧光探针（所有激发和发射波长）都兼容，具有普遍的适用性，是多态性检测和各种荧光检测的最佳选择。

图2：与其他转印膜相比，Immobilon^TM-FL具有极低的荧光背景。

3.可检测飞克级蛋白的底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物

化学发光检测中的酶催化反应可产生可见光，如辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。这种方法具有检测速度快，安全，灵敏等特点。传统低灵敏度的底物仅限于皮克级（10^-12 g）的蛋白检测，这些底物无法检测到低丰度表达的蛋白。

Millipore最新推出的高灵敏度底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物，能够检测飞克级（10^-15 g）的蛋白质，是检测低丰度蛋白质必不可少的工具。对于中等或高丰度蛋白，该底物所使用的一抗和二抗的量比使用传统检测底物所需的量低20倍，极大地节约了抗体的使用，降低了实验的成本（如图3）。而且，由于抗体浓度的降低，也有助于减少非特异的杂交背景，使Western的结果更加清晰，信噪比更高（如图3）。