 HRM技术服务之甲基化检测（MS-HRM技术）

    DNA甲基化是发生在DNA碱基序列上的一种共价修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5''''-CpG-3''''双核苷酸序列的胞嘧啶上。在人类基因组中，大约有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物种和细胞类型而异。DNA甲基化状态在基因组中呈现出一定的分布模式，90％的甲基胞嘧啶位于重复序列上。DNA甲基化可以遗传，并改变了DNA的结构特性与基因活动方式。

DNA甲基化意义：

    靶序列上甲基基团的存在可以影响转录因子的结合，引起转录抑制，从而使该基因表达受到抑制。启动子区CPG岛的甲基化常常可以抑制该基因的转录，尤其是对于抑癌基因，凋亡相关基因，DNA修复基因等，启动子区域发生甲基化会影响功能的发挥。不同的肿瘤组织基因甲基化状态不一样，可以作为早期检测，监测肿瘤形成的重要标志物。对于某些特异基因的甲基化，更加重要，如DNA修复基因，可以引起对化疗药物的敏感，从而作为药物治疗疗效的评价指标，指导临床用药。

检测方法：

    甲基化特异性PCR、Northern印迹法、Western印迹法、免疫细胞化学等，这些检测方法需要花费大量时间，成本高，在临床推广应用时均存在一定的困难。
高分辨率熔解（High  Resolution Melt,HRM）是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的一种新技术，主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

作为新一代的遗传扫描工具，HRM具有“简、效、快、廉”等其它技术难以比拟的优势：

简：无需序列特异性探针，不受碱基位点局限，同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点；闭管操作，避免交叉污染。

效：最低检测0.1%-0.01%的突变或异常甲基化，检测SNP灵敏度和特异性均为100%。

快：1次同时检测不多于384个样本，在60-90分钟内完成检测。

廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探针等方法。

    HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。

DNA甲基化-HRM检测原理：

    甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-High Resolution Melting Curve Analyse）是一种不需要 PCR 产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现并且可以在一些列的 CpG 位点中检测出单一的一个甲基化的发生，同时，也可以对一系列的 CpG 位点的甲基化水平进行分析。单个 CpG 位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。采用重亚硫酸盐处理 DNA 模板可以使 5-甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在PCR反应前，在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA 链的引物，这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化，使胞嘧啶（C）不发生变化，而与未甲基化的胞嘧啶（C）转变成胸腺嘧啶（T），样品中的 GC 含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线 Tm 值之间的差异。 CpG 位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响，因此，根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度。

HRM方法操作简单、灵敏高、重复性高、成本低、不受检测位点的局限高度等等优势，将对于遗传学、肿瘤学等方面的研究和临床应用提供更大的帮助。