韩国浦项科技大学Sungjune Jung教授团队使用MicroFab的按需喷墨生物打印系统Jetlab II制备了三维（3D）肺泡屏障模型，以评估尘埃颗粒对细胞毒性、肺泡屏障结构和肺泡屏障表面活性物质分泌的生理影响，研究尘埃颗粒如何导致呼吸道疾病。全喷墨打印的肺泡屏障模型能够高精度地模拟身体中的生理现象，可以用作毒理学的临床前模型，并有助于将新发现转化为有效的治疗策略。
介绍
空气中的微小尘埃颗粒通过呼吸道进入我们的身体，并导致严重的呼吸道疾病。因此，分析尘埃颗粒对呼吸系统的影响一直受到人们的极大研究兴趣。目前对于尘埃颗粒进攻人体肺泡过程的研究类似于2D模型，并且在体内发生的一些现象是经过模拟推演的，无法准确表达其过程。Sungjune Jung教授团队利用喷墨打印技术，通过在多孔基板上以高分辨率精确定位打印细胞，实现了对人体三层肺泡屏障模型的复现，从而在体外研究人类肺泡屏障中的尘埃颗粒毒理学。
▲ 图1 研究过程示意图。a)采用喷墨生物打印技术依次堆叠而成的肺泡屏障结构；b)肺泡屏障构建体的培养与成熟；c)尘埃颗粒毒理学研究。
肺泡屏障结构是通过使用MicroFab按需喷墨生物打印系统Jetlab II逐层打印四种不同的细胞类型来制造的，如图1所示。将NCI‐H1703, NCI‐H441, MRC5, HULEC‐5a四种细胞溶液，经过MicroFab喷墨打印系统精准量化打印，打印的模型具有三层结构，厚度约为10μm。通过叠层打印的方式（如图1a），实现内皮细胞-基层细胞-上皮细胞的三层3D结构，再经过7天的培育（如图1b），完全复刻人体内肺泡器官的组织结构，并使用全喷墨打印的肺泡屏障结构评估了大气尘埃颗粒的危害。
▲ 图2 尘埃浓度和暴露时间对肺泡屏障结构的活力和性能的影响。
分析用不同浓度的尘埃（0-300μg/cm2）处理不同暴露时间（1-7天）的肺泡屏障结构。为了验证尘埃颗粒对组织增殖和代谢活性的有害影响，在每个时间点进行了CCK-8测定，如图2a，如图2b测量TEER，以确定暴露于尘埃后的组织屏障的完整性。图2c根据FITC-葡聚糖通过组织屏障的量来测定屏障通透性。100和300μg/cm2组暴露于颗粒物5天，导致屏障电阻显著降低，对4 kDa FITC‐葡聚糖的渗透性显著增加。
▲ 图3 尘埃暴露后肺泡屏障结构中的细胞调亡。
为了观察尘埃处理的肺泡屏障结构中的细胞凋亡，进行了TUNEL测定，如图3所示。TUNEL染色结果显示，由于尘埃颗粒的浓度和时间依赖效应，随着尘埃暴露时间的增加，暴露于浓度为100μg/cm2或更高的尘埃会三层结构坍塌，导致更多的细胞凋亡。
▲ 图4 尘埃暴露7天后，肺泡屏障结构的功能表征。
暴露于尘埃后7天，进行免疫组织化学分析，以证明三层组织屏障中基底膜的结构组成，如图4所示。图4a研究了层粘连蛋白在基底膜中的分布，图4b对IV型胶原进行了免疫染色，图4c研究了上皮中ATII细胞的表面活性剂分泌功能。
▲ 图5 肺泡屏障构建中mRNA的表达。
为了研究尘埃颗粒的影响，进行了定量PCR（qPCR）来确定与细胞外基质降解和肺功能障碍相关的mRNA表达水平。利用涉及促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）（图5a、图5b）、基质金属蛋白酶（MMP‐1和MMP‐9）（图5c、图5d）、整合素亚基（ITGA1和ITGB1）（图5e、图5f）和肺表面活性物质蛋白（SP‐A和SP‐B）（图5g、图5h）的特异性标记物，通过qPCR检测相对mRNA的表达。结果显示，组织暴露于300μg/cm2的尘埃颗粒7天后，促炎细胞因子和MMPs的mRNA水平显著升高。研究表明，尘埃颗粒有助于导致ECM周转和结构变化的酶的高表达水平，相反，整合素和表面活性剂蛋白的mRNA表达水平随着尘埃浓度和暴露时间的增加而降低。因此，尘埃颗粒会抑制肺泡组织中呼吸表面活性剂的分泌，并有可能导致表面活性剂相关的生理功能障碍。
结论
全喷墨打印的肺泡屏障结构的研究为吸入尘埃颗粒的有害影响提供了三个主要的新见解。暴露于高浓度尘埃颗粒的肺泡组织中的现象包括：1.促炎细胞因子的表达增加；2.组织结构的破坏和紊乱；3.与呼吸系统疾病相关的基因的上调或下调。全喷墨打印的肺泡屏障模型非常接近人体肺泡组织的形态、功能和微环境特征，意味着现代医学可以使用全喷墨打印的方式来模仿制造人体器官可以用作毒理学的临床前模型，并有助于将新发现转化为有效的治疗策略。
参考文献：
[1] Kang, D., Lee, H., & Jung, S. (2022). Use of a 3D inkjet‐printed model to access dust particle toxicology in the human alveolar barrier. Biotechnology and Bioengineering, 119, 3668–3677.