发表期刊：Frontiers in Pharmacology
发表时间：2021年4月
影响因子：5.81
合作客户：重庆医科大学
百趣生物提供服务：中药非靶标代谢组学
01 研究背景
糖尿病是一种慢性代谢疾病，是世界上最重要的健康问题之一。患者数量多，据统计全球糖尿病患者数量将在2035年达到5.92亿。糖尿病肾病(DN)是糖尿病引起的常见微血管并发症，是终末期肾功能衰竭(ESRD)的主要原因。糖尿病肾病组织损伤包括系膜扩张、基底膜增厚和肾纤维化。肾纤维化的发展是糖尿病肾病患者肾功能持续下降并最终发展为终末期肾病的重要原因。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，足细胞损伤时引发糖尿病肾病持续性蛋白尿和肾纤维化的重要原因。足细胞作为终末分化细胞，受损难再生。因此，足细胞具有很高基础自噬水平在面对各种刺激时保持自身的动态平衡。在糖尿病肾病患者体内足细胞的自噬活性受到抑制，自噬主要受mTOR通路调控，抑制mTOR通路可以促进自噬，改善足细胞损伤和肾功能。因此，靶向mTOR通路可能是治疗DN的一种合适的治疗方法，促进自噬活性，改善足细胞损伤和肾脏病理损伤，恢复肾功能。
糖尿病肾病的治疗措施主要包括控制血糖、血脂、血压和应用血管活性药物。厄贝沙坦作为血管紧张素II受体阻滞剂是临床治疗糖尿病肾病的代表性药物，能有效降低患者的蛋白尿。在一定程度上延缓了DN的发展，但不针对肾脏损伤，难以完全预防肾功能衰竭。因此，有必要开发安全有效的治疗方法。益气解毒化瘀汤(YJHD)是一种经改良的中药方剂，已用于临床治疗糖尿病肾病(DN)。YJHD由七种草药组成，其中黄芪、葛根、黄连和桑叶已被证明对糖尿病及糖尿病并发症有治疗作用。重庆医科大学曹文富课题组轩晨在相关研究工作中，使用YJHD，旨在调节PI3K/Akt、AMPK和mTOR通路的活性，促进自噬，减轻足细胞损伤和肾脏病变，改善肾功能。
将Sprague-Dawley小鼠随机分为空白对照、阴性对照、糖尿病模型、厄贝沙坦处理(阳性药物组)和低、中、高（YJHD-L、M、H）3个剂量处理组。用链脲佐菌素复制动物模型，然后YJHD治疗，连续12周。实验期间采集血液和尿液样本，并对代谢和肾功能进行了评估。通过肾脏形态、苏木.精-伊红染色、马森染色、高.碘.酸席夫染色、高.碘.酸席夫甲.胺染色和透射电镜观察，评价肾脏病理损伤程度。采用免疫组织化学、蛋白印迹分析和实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)分别检测蛋白和基因的表达水平。
03 研究结果
1.YJHD成分鉴定（百趣中药非靶）
客户送中药口服试剂到我司检测，采用UHPLC-MS/MS对YJHD样品进行了测定分析，揭示了所有化合物的化学组成。共鉴定出15个活性成分(图1C)：1)萼花苷-7-葡萄糖苷，2)山.奈酚，3)黄芩素，4)木犀草素，5)萼花素，6)黄芪甲苷IV，7)槲皮素，8)异鼠李素，9)橙皮素，10)芦丁，11)巴马汀氯，12)芒柄花素，13)隐丹参酮，14)小檗碱，15)葛根素。
图1. YJHD化学成分鉴定
2.糖尿病症状改善和肾功能保护
测定阴性对照组和空白对照组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，以评价YJHD的安全性。证实YJHD无肝毒性作用(图2J)。药物干预处理后，发现对照组体重增加，而糖尿病组生长停滞。与糖尿病组比较，YJHD-H组小鼠体重明显增加。与空白对照组相比，其他处理组小鼠24小时摄食量和饮水量均显著增加。YJHD-H组的对于糖尿病症状的改善最为明显（评估指标:24h尿量、24h尿蛋白定量、血清Cr等），证实YJHD能改善糖尿病小鼠的症状和肾功能，其中以高剂量组的效用最为明显。
图2. YJHD改善糖尿病症状和肾功能
3.YJHD减轻肾组织病理损伤
作者通过对比7组小鼠肾脏外观，HE、PAS、PASM染色和透射电子显微镜下肾脏组织结构形态图，糖尿病组小鼠肾脏增大，组织形态异常，系膜区扩张，细胞外基质(ECM)积聚，基底膜增厚，足细胞形态异常，足突融合缺失。阳性药物组和YJHD-H组能够明显减轻糖尿病小鼠肾脏损伤。
图3. YJHD减轻肾组织学损伤
4.YJHD改善肾纤维化
作者通过肾组织染色、qPCR、Western blot和免疫组织化学方法检测了ECM的主要成分IV型胶原和纤维连接蛋白的表达水平。发现与糖尿病小鼠相比，YJHD-H组肾脏胶原纤维数量明显减少，肾纤维化程度明显改善，并且显著降低肾脏IV型胶原和纤维连接蛋白表达。证实了YJHD-H有效减缓糖尿病肾病小鼠肾脏纤维化。
图4.YJHD改善肾纤维化
5.YJHD减轻足细胞损伤
作者通过透射电镜观察小鼠细胞形态，糖尿病肾病小鼠足细胞形态受损，足突融合，而对照组则显示正常的细胞形态。此外，测定各组足细胞的podocin和neparin表达，其在糖尿病组表达显著降低，证实了糖尿病组小鼠足细胞减少。阳性药物组和YJHD-H 均能促进其表达，从而减轻足细胞损伤。表明YJHD-H小组能够减轻糖尿病肾病小鼠足细胞损伤。
图5. YJHD可减轻足细胞损伤
6.YJHD促进自噬
作者通过评估对细胞自噬起重要作用的Beclin-1、p62和LC3II基因的mRNA和蛋白表达水平来评估自噬程度。发现糖尿病组小鼠自噬受到抑制，YJHD-H 组通过上调Beclin-1和LC3II的表达，下调p62的表达促进自噬，推测这可能是其减轻足细胞损伤的机制之一。
图6.YJHD对自噬的影响
7.YJHD对mTOR通路的影响
mTOR途径是调节自噬的关键途径，激活的mTOR磷酸化ULK1抑制足细胞自噬。作者测定了mTOR、p-mTOR及其下游的ULK1和p-ULK1在肾脏中的表达水平。糖尿病小鼠mTOR、p-mTOR和p-ULK1表达显著增加。与其相比，YJHD-H组mTOR、p-mTOR和p-ULK1表达显著降低，结果揭示了YJHD-H组可抑制mTOR通路的激活。
图7.YJHD对mTOR通路的影响
8.YJHD对PI3K/Akt和AMPK通路的影响
mTOR途径主要受PI3K/Akt和AMPK途径调控。作者测定了肾脏中PI3K/Akt和AMPK途径蛋白的表达。与糖尿病组比，YJHD-H组小鼠通过降低IRS1和p-Akt表达，抑制PI3K/Akt通路，这与抑制mTOR通路的作用一致。AMPK通路对自噬有正向调节作用，这与抑制mTOR通路激活有关。与糖尿病组比较，YJHD-H组小鼠通过LKB1和p-AMPK的表达，激活AMPK途径。
图8. 对PI3K/Akt和AMPK通路的影响
图9. 自噬过程示意图
04 结论作者在这个实验中验证了YJHD通过调节PI3K/Akt和AMPK通路的活性，进一步抑制mTOR通路，促进自噬，从而改善足细胞损伤，保护肾功能，减轻肾纤维化。本研究为YJHD的应用和进一步研究提供了依据。
百趣生物在客户提供的中药试剂中测出15种活性成分，在作者后期的研究中可以采用中药入血分析和网络药理学分析，明确哪种活性成分参与到PI3K/Akt和AMPK通路的活性调节，进而改善肾纤维化和提升足细胞的自噬水平，为糖尿病肾病医治提供新思路。
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