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中国学术和产业界大机会-靶向蛋白降解专家服务开启!

作者:北京爱思益普生物科技股份有限公司 2022-06-15T10:10 (访问量:3035)

PROTAC(Proteolysis-Targeting Chimera)称作蛋白水解靶向嵌合体,通常含有三个部分:一段与靶蛋白结合,一段与泛素连接酶(E3)结合,中间靠linker相连。近日清华大学饶燏教授团队又发表一篇围绕PROTACs在学术界和工业界进展综述,很振奋人心,文中罗列了非常多的可被降解靶点,之前饶教授实验室对PROTAC分子就有过系统汇总,短短两年多的时间,该领域又有了很多突破。PROTAC分子的独特性,深深吸引许多科学家,该分子的研发紧密地连接了药化、化学和生物的团队。设计PROTAC分子,不按常理设计、不按常理优化、不按常理检测、也不按常理合成、也不能按常规分子一样分析,特别受到科研届和工业界的钟爱。PROTAC分子的特殊性,一边为这类分子的研发和优化带来新挑战,也为新型化合物的设计带来很多可能。

吸引爱思益普团队(ICE)的一个主要因素,是PROTAC研发过程中艰难和挑战是非常多的,需要多方位平台的融合与合作!爱思益普团队积极布局PROTAC分子评价和筛选,在蛋白表达、二元复合物结合、三元复合物形成、蛋白降解、细胞增殖抑制、细胞信号通路调节的评价、HiBiT敲入细胞系的构建等方法开发中有丰富经验积累。PROTAC需要结合到靶点并发挥介导降解作用,需要经过细胞膜进入细胞,需要结合到靶点,同时需要结合E3形成三元复合物,并在空间上符合E3介导的泛素化过程。此处需要考虑几个关键的步骤:PROTAC分子的稳定性,透膜性、与靶点的亲和力、与E3的亲和力、三元复合物形成的能力、靶点细胞中E3表达水平及和靶点相互匹配E3种类,泛素化过程、蛋白降解动力学、信号通路变化、细胞表型变化、脱靶效应、细胞毒性等等环节。

PROTAC分子的细胞之旅

爱思益普布局PROTAC分子研发能力平台

细胞水平可优化蛋白降解与表达水平检测技术,比如传统Western blot、毛细管Digital Western、高通量ICW和IFA等,也可利用商品化试剂如AlphaLISA、ELISA、HTRF等方法检测总蛋白表达水平;同时结合细胞信号转导通路检测、细胞活力与增殖等层次,多方位确定在细胞中PROTAC分子活性。

案例分享:

在Ramos或OCI-LY10细胞研究降解水平。根据目前经验,在优化方法早期,会利用传统Western blot实验看趋势,再结合毛细管数字化Western blot(ProteinSimple旗下JESS平台)确定降解情况,用于后续筛选。在抗体浓度优化和蛋白上样量两个角度摸索线性关系,确保后续定量分析准确可靠。

传统电泳Western Blot实验(ICE数据)

相比传统电泳Western Blot实验而言,JESS则显得更为便捷,制备样本流程简单。Jess平台是一款完全自动化western blotting系统,在3小时内提供24个样本数据。通过免疫分析或总蛋白分析2-440 kDa蛋白质。可获得准确定量结果和再现性,并且在此过程中使用更少样本。Jess系统与传统western blot检测之间最大区别是Jess仪器是一款基于毛细管的无凝胶、无斑点和免手动免疫分析平台,可集成并自动化整个蛋白质分离和检测过程。每天可保证两轮实验,保证了实验的时效性、稳定性和可重复性。产生的信号可直接量化处理,也保证了实验灵敏度。

如下图所示,JESS量化关系清晰,其线性关系也可直接用仪器计算并导出,选好条件,即可直接用于后续蛋白表达水平检测。目前ICE团队已用JESS顺利完成多项蛋白降解相关实验。

数字化Western Blot-JESS实验(ICE数据)

待初步测试条件摸索完毕,下一步将会测试化合的DC50和Dmax,此处JESS得到的结果如下图,可以清晰地看到化合物降解作用。该流程易于上手,确定好样本处理条件之后,结果相对稳定,可比较不同批次实验数据见的相对活性。

数字化Western Blot-JESS实验(ICE数据)

对于JESS而言,还有一个优势就是厂家已有的验证数据。根据之前的经验,只要抗体和样本制备流程一致,JESS实验可重复概率较大,利于快速推进蛋白含量检测。结合饶教授综述文章中提到的一些靶点(见文后附录),大部分靶点有验证数据,这大大地减少了方法摸索过程。

数字化Western Blot-JESS实验(ProteinSimple官网数据)

数字化Western Blot-JESS实验(ProteinSimple官网数据)

对于大量PROTAC分子细胞活性筛选,也可用微孔板方式如优化的In-cell western(ICW)和Immunofluorescence assay (IFA),ELISA、Alphalisa等技术,也同样适合检测BTK和pBTK水平,此类实验得益于优质抗体。对于高通量筛选,也有项目使用HiBiT内源敲入细胞系,快速筛选可降解BTK蛋白的PROTAC分子,同时可看到降解动力学过程及对细胞增殖过程的影响。

PROTAC技术也有局限性,所以一些研发团队也在尝试不同技术手段,摸索新的蛋白降解方式,如分子胶,LYTACs,AUTACs,ATTECs,RIBOTACs,PhosTACs,以及Degrader-antibody conjugates等等,对于膜蛋白而言,ICE有着丰富的稳转细胞系储备如离子通道、GPCR受体等,可在膜蛋白降解领域提供更多服务项目。

中国之创新,关键是处理好“产、学、研”之间的相互关系,或许会给创新带来新突破,爱思益普致力于与中国蛋白降解药物研发企业和**的专家教授合作,共同促进中国蛋白降解领域发展!

关于爱思益普

爱思益普致力于建立全面的靶点筛选和体外生物学研究平台,建立一系列基于生物学和药理学的研究技术集群,为客户提供涵盖各种靶标和疾病领域的新药研发服务,包括从活性化合物发现,靶标验证,先导化合物优化到临床前候选药物的选择。公司建立了100+离子通道,100+GPCR,800+酶学靶点以及40+核受体筛选细胞系及验证方法,涵盖了大部分成药性靶点,在国内具有**水平和竞争优势。公司建立了蛋白纯化,生化酶学,肿瘤细胞学,免疫学,电生理学,心脏体外研究,中枢神经系统药理学,药物脱靶效应筛选,药物心脏安全性评价,ADME等平台,全面支持创新药研发的DMTA(设计,合成,测试,分析)一体化服务。爱思益普为国内新药研发机构超过600家以上机构提供服务,得到客户广泛好评。

爱思益普目前拥有7000平方米实验室,200多名员工,仪器设备投入超过5000万元,2人入选北京市“海聚工程”海外高层次人才及北京市特聘专家。是国家高新技术企业,中关村高新技术企业。2021年服务全国创新药研发生物科技企业超过300家,每年数十个项目进行新药临床研究(IND)申报,多个项目通过NMPA的现场核查。

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