随着城市化的发展，来自交通、工业、资源开采、建筑和娱乐活动的噪音污染在时间和空间上不断扩大，陆地和水中的人为噪声增加，对人类和野生动物的健康造成了越来越多的不良影响。有研究表明，长期暴露于人为噪声会对鱼类物种造成包括生存能力下降、生长受损、生理压力等方面的的负面影响。基于目前快速变化的水下声音景观，研究不同的噪声状况如何影响鱼类的发育、生理和行为至关重要。本文测试了暴露于不断增加的和不同时间模式下的噪音对斑马鱼幼鱼发育、生理压力和行为模式的影响，以探究噪音如何影响动物的个体发育情况。
实验方法
本研究通过测量暴露于不同噪声水平和时间模式变化的实验组之间，斑马鱼孵化率、总长度、死亡率、心率、皮质醇水平等实验数据，来研究噪声对斑马鱼幼鱼的发育、生理压力和行为模式的影响。
实验对象
在斑马鱼受精后2小时，从2至6个繁殖箱（每个箱包含约10只雌性和5只雄性）收集鱼卵。将收集的卵混合在含有胚胎培养基的单个培养皿中，并分配到不同组，每组50个样本，共分为3-5组，每组被分配到不同的声学实验箱。
实验设计
为了测试振幅对斑马鱼幼鱼的影响，研究使用两个不同振幅或声压级（SPL）的连续白噪声（CN）声音文件，即130 dB（CN130）和150 dB（CN150），这些噪声水平与淡水水生环境中的人为噪声相似，用来模拟人为水中噪音。
为了评估不同噪声时间机制的影响，生成了三个额外的间歇噪声和60分钟持续噪声（图1）。三个额外的间歇噪声为：IN1-持续时间为5-12 s的短噪声段，间隔为1-120 s的无声间隔（每小时60次噪声事件），达到约15%的总噪声暴露；IN2-30-60秒的中等噪声段，间隔1-10分钟的静默，每小时15个噪声段，总体噪声暴露与IN1相似；和IN3-15分钟的长噪声段，间隔15分钟的静默期（约占总噪声的50%）。测试所用声音通过软件将声音调整为相对平坦的频谱，放置于声学实验箱中的水下扬声器进行播放。
实验数据采集
上午10点至11点，检查受精后48小时胚胎存活率。两个发育阶段，即受精后3天和受精后5 天，在每天早晨固定时间收集斑马鱼形态学和生理学数据。
图1
斑马鱼测量指标
（1）形态学和心率测量。在每个实验中，评估声学处理对斑马鱼幼体形态发育和心率的影响。本研究使用Noldus 斑马鱼微视行为分析系统对斑马鱼进行形态学分析及自动检测心脏活动。
斑马鱼微视行为分析系统（DanioScope）是用于评估和分析斑马鱼胚胎及幼鱼活动的专业软件。该系统可以通过视频文件和静态图像测量斑马鱼胚胎及幼鱼胎动、心跳、血液（和肠道）流动、形态学特征等多种实验数据。并且，系统支持高通量的斑马鱼测试，可以节省实验准备、获取数据和分析结果的大量时间，提升研究效率。
（2）卵黄囊&皮质醇测量。分析基于两个不同发育阶段的斑马鱼幼鱼，以测试噪声水平增加和不同噪声时间模式对卵黄囊和皮质醇生理指标的影响。
（3）光/暗选择测量。用于评估斑马鱼幼体的环境压力，通过在光亮侧花费的时间百分比的增加反映了该模型生物体的焦虑情况。
（4）行为模式。本研究会对斑马鱼幼体进行自发交替行为（SAB）测试，该行为指动物在环境下连续转弯过程中交替转弯方向的趋势，用来探究噪音对斑马鱼行为模式的影响。
实验结果
孵化、生长和死亡率
本研究中使用的噪声对斑马鱼胚胎的孵化率没有显著影响，也没有引起明显的胚胎发育异常。此外，噪声水平和时间模式的变化不会影响测得的斑马鱼的总长度。但是，在连续噪声（CN）下，观察到CN150噪声暴露导致斑马鱼死亡率显著增加（图2，C）。噪声时间的变化也导致所有噪声暴露组的死亡率增加（图2，D）。间歇性的短噪音（IN1）和中噪音（IN2）周期导致较高死亡率，而呈现长噪音段（IN3）的治疗与对照组相比未导致显著死亡率（图2，D）。
图2
生理应激指标。心率、卵黄囊消耗和皮质醇水平随着噪声水平的增加而显著增加，这清楚地表明斑马鱼较高的生理应激。对照组幼鱼在受精后3天时的心率约为173±30 bpm，在播放CN150后增加到191±60 bpm。而在受精后5天时，心率约为203±40（对照组），在CN150处理后增加到224±50 bpm。在受精后3天和5天幼鱼中，随着噪声水平的增加，证实了心率的显著的增加，与对照相比，CN150引起的差异最大（图3，A）。
同样，在受精后3天和5天幼鱼中，与对照组相比，随着噪声水平的增加，卵黄囊消耗量显著增加（图3，B）。噪音干扰时间的变化对心率和卵黄囊消耗产生影响，表明噪声时间机制对于调节生理应激和胚胎内源性能量储备的消耗非常重要。
在受精后3天和受精后5天，心率受噪声时间变化的显著影响，与受精后5天的间歇性噪音相比，连续噪声造成的影响最大（图3，C）。此外，这些噪声处理之间的卵黄囊消耗量存在显著差异（图3，D）。总体而言，心率与卵黄囊大小呈负相关，这意味着心率较高的个体消耗能量储备更快（图3，E）。
通过皮质醇测量证实了噪声诱导的生理应激，皮质醇水平随着噪声振幅的增加而显著升高（图4），噪声时间机制的变化导致皮质醇的变化。
图3
图4
行为模式。为了评估行为水平的潜在变化，使用焦虑相关的光/暗选择测试（图5，A），进一步测试了暴露于150dB连续噪声（CN150）受精后5天的幼鱼。根据测量，暴露于噪音的样本表现出较强的避暗或暗视症（图5，B）。同时，使用自发交替行为（SAB）实验（图6，A）测试了斑马鱼幼鱼的探索行为。结果显示，在无声控制条件下饲养的70%的幼鱼表现出正常的游泳交替，而噪声处理组（CN150）仅为34%（图6，B）。在旷场中进一步研究了这些样本的游泳模式，发现噪声处理过的幼鱼的覆盖面积减少。
图5
图6
讨论
本文测试了不断增加的噪声程度和不同的噪音时间机制对斑马鱼幼鱼的影响。研究结果显示：
1. 噪声不影响一般斑马鱼胚胎的发育或孵化，但较高的噪声水平会导致死亡率增加；
2. 在受精后3天和5天，斑马鱼心率、卵黄囊消耗量和皮质醇水平随着噪声水平的增加而显著增加；
3. 噪声时间模式的变化表明，噪音持续的机制比噪声暴露的总时间更重要；
4. 暴露于连续性高噪声的斑马鱼幼鱼在焦虑相关的明/暗选择测试中表现出更高的暗回避能力，并且自发交替行为受损；
本文通过研究噪音对水生生态系统中斑马鱼幼鱼的发育、生理压力和行为模式等的影响，强调了对噪音管理的重要性。
参考文献
Lara R A, Vasconcelos R O. Impact of noise on development, physiological stress and behavioural patterns in larval zebrafish. Scientific Reports, 2021, 11(1): 1-14.
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