机制复杂难定，治疗药物多样多变，如何抢占制药先机？
筛选领域再起风云，AD模型再次突破，整体治疗多药验证！
摘要：杭州环特生物科技股份有限公司与浙江省医学科学院药物研究所联合在《Journal of Pharmacy and Pharmacology》上发表文章，介绍了用斑马鱼模型快速筛选阿尔兹海默症治疗药物的研究成果，该研究以斑马鱼整体行为学作为主要指标，用6种不同机制药物（化合物）验证了用斑马鱼模型快速筛选阿尔兹海默症药物的可靠性。
AD（阿尔茨海默病）是一种复杂的神经变性疾病，常常导致认知功能下降，是造成老年痴呆的主要原因。尽管有众多的体外和体内实验能证明AD疾病发生时伴有乙酰胆碱的水平降低、过氧化、金属离子水平升高、Aβ（淀粉样蛋白β）聚集等情况，但是AD的发病机制仍有待阐明。
为了筛选有效的抗AD药物，能模拟AD病理过程的实验动物模型是必不可少的。长期以来，小鼠筛选系统一直占着阿尔茨海默氏病研究中的主导地位。近年来，斑马鱼模型引起了学者的极大关注，并由于成本效益被广泛使应用在实验中。例如，帕凯等人开发出了一直tau蛋白的转基因斑马鱼模型，用来定位tau蛋白磷酸化的化合物。而且斑马鱼模型能很好地识别出GSK3β抑制剂，如潜在AD靶向治疗药GSK3，就会导致斑马鱼胚胎脑部减小。然而，大多数的斑马鱼AD模型都是转基因品种，需要极大的时间和金钱成本，因此新的且能快速筛选抗AD药物的斑马鱼模型是及其有必要的。
氯化铝是一种用于诱导啮齿类AD模型的标准化学品，用氯化铝可以减慢6-8个月的斑马鱼的游动速度，和AD患者的运动障碍现象十分相似，因此可以用氯化铝来诱导制造新的斑马鱼AD模型。之所以选择受精后3-5天的幼鱼，而不是先前所述的6-8个月的成鱼做实验是为了更好地进行高通量药物筛选并削减成本。以多奈哌齐（DPZ）为阳性药在实验中不断地对三个条件，即氯化铝暴露浓度、暴露周期和药物治疗浓度上对模型进行了优化后成功建模，并验证了该模型的可靠性和可重复性（表2）。
用6种具有多种作用机制的，或上临床或上市的AD治疗药物对模型进行了验证，以光线的变化后的运动障碍恢复率（DRR）和反应能力（RE）为量化指标来评价药效。结果表明，RE可以作为一个可靠和方便的测量指标来评估6个抗AD药物；而DRR这一评价指标对利凡斯的明（Rivastigmine），硫黄素T（Thioflavine T，ThT），氟比洛芬（Flurbiprofen）和AM-117，但不能评价美金刚（Memantine）和罗格列酮（Rosiglitazone）。我们建议，新的斑马鱼AD模型可用于新型抗AD化合物的高通量初筛实用系统。
让我们一起来看看每个药物在斑马鱼上的不同处理结果吧！
利凡斯的明（Rivastigmine）——乙酰胆碱酯酶抑制剂
利凡斯的明是5种被批准用于AD治疗的乙酰胆碱酯酶抑制剂中的一种，也是世界上最畅销的抗AD药物之一，并且在斑马鱼上发现其是6种药物中有最高无明显损害作用水平（NOAEL）且恢复速度较好（运动障碍恢复率 = 53.4-64.0％，P <0.005；反应能力=86.6-175.1％，P <0.0001）。
美金刚（Memantine）——N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂
除了乙酰胆碱酯酶抑制剂外的另一个批准上市的重要的抗AD药物是美金刚，是N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。美金刚可阻断N-甲基-D-天冬氨酸受体，减少钙溢流入神经元细胞而导致的死亡并减轻AD症状。分别用低中高三种浓度的美金刚处理后，斑马鱼的反应能力有明显提升，但运动障碍恢复率没有观察到显著变化。这一结果表明，在这个模型上运动障碍恢复率可能无法成为美金刚的指标，但是，反应能力可以被用作测量的参数靶向筛选抗AD药物N-甲基D-筛选天冬氨酸受体药物。
硫黄素T（Thioflavine T，ThT），氟比洛芬（Flurbiprofen）和罗格列酮（Rosiglitazone）
Aβ（淀粉样蛋白β）在AD的发病机理中发挥着重要的作用，而增加IDE（胰岛素降解酶）的水平会活化PPARγ受体进而促进Aβ在大脑中的降解。ThT是Aβ凝聚抑制剂，而氟比洛芬和罗格列酮，是被批准的非类固醇抗炎药和降血糖药，分别作为γ分泌酶抑制剂和PPARγ激动剂正处于临床实验中。
运动障碍恢复率不能评价罗格列酮可以通过罗格列酮的机理进行说明。罗格列酮是作用在Aβ降解阶段的，在聚集和生成阶段的后面。因此，要罗格列酮影响到运动障碍恢复率可能需要更长的时间。
值得注意的是，用10μM氟比洛芬处理的的所有斑马鱼都死了。这些结果表明，高浓度的γ分泌酶抑制剂和铝离子可能对斑马鱼有毒副作用。另一个原因可能是由于γ分泌酶抑制剂的副作用，该治疗会影响到关系神经细胞生长的Notch信号通路。这一结果和小鼠模型是一致的，因此可以用此模型筛选γ分泌酶抑制剂并用于抗AD药物的筛选。
AM-117——乙酰胆碱酯酶抑制剂和亲金属螯合剂
有研究表明在AD患者中的金属离子水平是健康个体的3-7倍，这表明大脑内金属（铁，铜，锌）水平的降低可能有助于AD治疗。此外，乙酰胆碱酯酶的抑制和金属离子的减少可以形成对AD治疗的协同效应，此外这两类药物还能通过不同的机制减少Aβ的凝聚。因此，AM-117，乙酰胆碱酯酶抑制剂和亲金属螯合剂，被设计为在我们的实验室MTDL（多目标导向配体）（无发表数据）。这并不奇怪，我们的数据显示，运动障碍恢复率测量是在对AM-117治疗剂量依赖性增加。