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外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)是ELISpot和FluoroSpot 分析中最常用的细胞。PBMCs主要包括两大类细胞，淋巴细胞（Lymphocyte）和单核细胞（Monocyte），其中淋巴细胞又包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞。高质量的PBMCs是完成ELISpot和FluoroSpot检测的基础。具有多年ELISpot和FluoroSpot 检测经验的Mabtech带您详细了解PBMCs分离、冻存和复苏全过程，帮助您获得高质量的PBMCs。

一.PBMCs分离

对于全血采集，市场上有多种不同抗凝剂的血液采集管。根据Mabtech的经验，柠檬酸盐和肝素抗凝剂的血液采集管最适合ELISpot。 如果需要大量细胞，PBMCs也可以从除去血浆和大部分红细胞后获得的白细胞浓缩物即白膜层中来制备。

材料：全血样本、无菌Ficoll-Paque分离液、无菌PBS或无血清培养基(例如，RPMI 1640)、无菌15mL和50mL聚丙烯离心管、移液器、无菌巴斯德移液管、无菌吸头、室温离心机

注意：正式开始之前确保所有试剂都恢复到室温，保证在无菌条件下操作。

步骤：

1.全血用PBS稀释2倍(例如，10ml全血+ 10ml PBS)。如果样本是血沉棕黄层，与全血相比，血沉棕黄层中的细胞密度更大，因此应该稀释更多倍数(大约3倍)。

2.准备含有Ficoll-Paque分离液的离心管。根据血容量，可以使用15ml或50ml的离心管。如果使用15ml离心管，向离心管中加入5ml Ficoll-Paque。如果使用50ml离心管，则向离心管中加入15ml Ficoll-Paque分离液。

欣博盛常备可代替Ficoll-Paque分离液的Lymphoprep分离液，以及除了分离细胞外还可分离细胞器，病毒等的OptiPrep分离液。

3.轻轻地将稀释的血液加入到Ficoll-Paque分离液的顶部，确保不要扰乱分离液的分层界面。对于15ml的离心管，加入8ml稀释的血液，对于50ml的离心管，加入25ml稀释的血液。请注意:加入稀释的血液时可以倾斜试管，将血液样本沿着离心管壁加入。

4.在室温下以缓升缓降的方式用400 x g的速度离心30分钟。

5.离心后，用巴斯德移液管小心收集在Ficoll-Paque分离液上层中的由单核细胞组成的白灰色层，并转移到新的离心管中。

6.以400 x g的速度离心10分钟以清洗离心管中细胞。

7.倒掉上清液，重悬沉淀，并加入PBS或无血清培养基。请注意：重悬细胞时，首先轻敲试管，使细胞沉淀变得松散一些。然后加入1-2 ml缓冲液或培养基，轻柔上下吹打。

8.以400 x g的速度离心10分钟清洗离心管中细胞。

9.倒掉上清液，重悬沉淀，并加入无血清培养基。

10.记录体积，吸取小份进行细胞计数。

11.以400 x g的速度离心10分钟以清洗离心管中细胞。

请注意：用Ficoll-Paque分离后，可能存在污染的红细胞(RBC)和粒细胞。如有必要，可以用商业化红细胞裂解液和粒细胞耗竭试剂清除。

12.如果需要立即使用这些细胞，则倒掉上清液，轻轻上下吹打，将细胞重悬在适当的细胞培养基中。PBMCs现在可用于基于细胞的免疫检测，例如ELISpot、FluoroSpot 和流式细胞术。

如果您需要冻存细胞，请继续参考第二个部分—PBMCs冻存

图1. PBMCs分离示意图

二、PBMCs冻存

材料：细胞冻存培养基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 20% FCS和10% DMSO（如果您的细胞适应无血清培养基，请使用7% DMSO）；1.8ml细胞冻存管；无菌15mL和50mL聚丙烯离心管；冻存盒，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；移液器；无菌吸头；-80℃冰箱；液氮冻存罐。

请注意：操作之前请将冻存管标记好，并确保准备好冻存盒。室温条件下细胞在冻存培养基中放置太久会影响细胞的活力。

步骤：

1.去除上清(上一节的步骤11 ),并在冻存培养基中将细胞稀释至500万至2500万个细胞/ml的浓度。如果使用的是无血清冷冻培养基，调整细胞浓度到100万个细胞/ml。

2.在每个冻存管中加入等体积细胞悬液，例如每管加入1 ml，并将冻存管转移到冻存盒中。

请注意：对于1.8ml冻存管，建议加入1ml细胞悬液。对于其他尺寸的冻存管，确保加入体积小于最大体积，因为液体在冷冻过程中会膨胀。

3.迅速将冻存盒放入-80℃的冰箱中，至少储存4小时，最多储存1周。

4.将冻存管从冻存盒转移到-150℃冰箱或液氮罐中，长期保存。

图2. PBMCs冻存示意图

三．PBMCs复苏

材料：细胞培养基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 10% FCS，10 mM HEPES和100 μg/ml青霉素+ 100μg/ml链霉素；无菌15mL和50mL聚丙烯离心管；移液器；无菌吸头；离心机；水浴锅；细胞培养箱

步骤：

1.准备工作：将水浴锅加热至37 ℃ ，预热细胞培养基，并将洗涤细胞步骤中使用的缓冲液恢复到室温。

2.迅速将冻存管从液氮罐或冰箱转移到37℃水浴锅中，解冻细胞，直到只剩下一小块冰晶。

请注意:如果您打算解冻多个冻存管，最好每次只解冻几个。冻存培养基中含有对细胞有毒的DMSO，因此需要尽快进行下面步骤。

3.向冻存管中缓慢加入0.5-1 ml预热的细胞培养基，在冻存管中重悬细胞并转移至15 ml离心管中。用1ml细胞培养基冲洗冻存管，并将其也转移到15ml离心管中。再补充合适体积的细胞培养基到离心管中。

4.以300 x g的速度离心10分钟清洗细胞。

5.倒掉上清液，轻敲离心管，使沉淀变得松散。通过缓慢加入细胞培养基，将细胞重新悬浮在1 ml细胞培养基中。再加入细胞培养基至总体积15ml。

6.以300 x g的速度离心10分钟清洗细胞。

7.倒掉上清液，将细胞重悬于1 ml细胞培养基中。再根据预期的细胞数量和所需的细胞浓度添加适量的细胞培养基。

8.将细胞静置于细胞培养箱中一小时。将盖子稍微拧松一些，便于气体交换。

9.细胞静置完成后，重新悬浮细胞，再静置1分钟让聚集的细胞碎片沉淀。然后小心地将无碎片的细胞悬液转移到一个新的15 ml离心管中。

请注意：每个15ml离心管中最多加入两个冻存管(大约3000-4000万个细胞)的细胞。

10.进行细胞计数并测定细胞活力。可以使用自动细胞计数器或使用台盼蓝染色显微镜观察来进行计数。因为只有活细胞才能够分泌靶标分析物，所以确保从细胞计数中排除死细胞和凋亡细胞。如果细胞浓度低于要求，再次离心细胞，重悬细胞并稀释至所需体积。

图3. PBMCs复苏示意图

温馨提示：本文中的实验步骤仅供参考，实验时请按照产品说明书操作。

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