2006年是荧光显微镜学的奇迹之年。而与之相媲美的另一个年份是1905年，当时爱因斯坦以相对论、量子论和原子物理学变革了物理领域。而这场显微镜学革命，则是由3篇论文组成的，科学家首次能窥见细胞内部并追踪单个分子的行为。

“每个分子是一台机器，一台纳米机器。”Bewersdorf说。其中，蛋白质是尤为复杂的分子，它们以多种方式弯曲缠绕，执行细胞新陈代谢和生长需要的反应。“我们感兴趣的是，这些微型机器是如何整合在一起完成细胞机能的？”

长期以来，光学显微成像技术的发展一直受制于一个物理极限值的约束，也就是德国物理学家、显微技术专家恩斯特·阿贝在1873年提出的预言：光学显微镜的成像效果被认为受到光的波长限制，无法突破0.2微米，即光波长1/2的分辨率极限，此后被称为“阿贝分辨率”。

在能够窥见细胞内部之前，科学家对该问题并没有清晰的答案。光学显微镜无法提供任何帮助，超越一定放大率后，衍射使得光线四散而非集中于一点。任何距离小于200纳米或宽度是细胞膜40倍的物体都会变成一个模糊点。使用电子显微镜制作的图片能分辨精细结构，但必须是静态的，无法用于活细胞。

2006年，3个实验室各自采用相似策略克服了“衍射障碍”：利用专业的荧光探针分析样本。这些探针能被有选择地开启，直到所有探针能在一系列图像中被捕捉到。科学家能像印象派画家利用颜色点构建一个场景那样将这些图像制作成一张图片。这3个技术——光敏定位显微镜（PALM）、荧光PALM（FPALM）和随机光学重建显微镜（STORM），能区分出相距20纳米的目标，产生单分子尺度的荧光照片。这些技术为研究人员插上前进的翅膀。例如，Bewersdorf在美国耶鲁大学的实验室正为活动在活细胞表面的蛋白质“照相”。

自2006年到现在的10年间，这3个技术掀起了技术和方法的革新浪潮。2014年，德国马克斯普朗克学会生物物理化学研究所的Stefan Hell、美国霍华德·修斯医学院珍妮莉娅法姆研究院的Eric Betzig和美国斯坦福大学的William Moerner提出的打破衍射极限的成像策略使他们成为诺贝尔化学奖得主。研究人员目前正在制造更明亮的荧光探针，以便照亮未曾展现在人们面前的细胞进程。

“令人兴奋的是，这些技术让观察活细胞成为可能。”珍妮莉娅法姆研究学院Jennifer Lippincott-Schwartz说，“目前，使用荧光探针拍摄单个蛋白质时机已经成熟。”

更持久、更明亮

这3个超分辨率显微镜技术都是依靠绿色荧光蛋白质（GFP）等化合物发出光线的。这些物质的基因能被插入编码细胞蛋白质的基因中。然后，生成的蛋白质中则附着着荧光物质，并通过发出荧光显示其存在位置。

但这些技术均存在限制。一个大问题是，在被刺激其发光的激光彻底损坏前，这些探针只能发出极为有限的光。甚至在光褪色效应发生前，探针的光已经非常微弱了。

而这些探针的综合版本有机染料，能发出更明亮的光，但却无法编码目标基因，并插入细胞内部。相反，它们通常与能找到蛋白质的抗体结合在一起。但这种组合使得探针过大，无法穿过细胞膜或干扰蛋白质功能。“这些探针确实存在限制。”Bewersdorf说。

幸运的是，革新正在出现。Bewersdorf团队正在与两个团队合作研究可点击化学探针：新英格兰生物实验室的SNAP-tag和普洛麦格生物技术公司的HaloTag。这些技术包含一种能被编码到兴趣蛋白质中的较短的靶序列和一个能通过简单化学反应嵌入靶蛋白中的染色分子。Bewersdorf和同事已经证明这两种技术能使用有机染料作用于活细胞。

另外，研究人员还求助于量子点——纳米级半导体。这种物质不仅明亮且持续一个月甚至更久，还能与生物分子相连接。新墨西哥大学生物物理学家Diane Lidke在细胞传导实验中就使用了量子点。但量子点存在一个缺点：体积过大。市场上能买到的量子点都有一个壳，这让其直径大了15~25纳米。与只有4纳米宽的荧光蛋白质相比，“它们太大太笨重了”。

这一缺点意味着研究人员很难将量子点放入细胞或其他紧密空间中，但能有效应用于在细胞外基质和膜结合蛋白中。在与其丈夫、该校物理学家Keith Lidke的合作中，Lidke开发出了多色、快速、单分子追踪技术，能用量子点在定制显微镜中生产图片。

打开细胞

穿越细胞膜是荧光显微镜面临的最大障碍之一。“即便只有5纳米厚，细胞膜已经进化了数十亿年，以便隔离细胞内外，而且，效果出奇地好。”伊利诺伊大学香槟分校生物物理学家Paul Selvin说。

Selvin的实验室开发出的量子点更小，直径接近9纳米。这一尺寸能让他将量子点滑过神经细胞之间20~40纳米的空隙，信息传导分子经由这里向相邻神经细胞传递信息。一旦进入这里，量子点能束缚并突出帮助记忆形成的受体的存在。虽然Selvin并没有将这些量子点植入活细胞内，但他认为这是可行的。

该实验室还计划在细胞膜上穿孔，然后迅速密封起来，以避免破坏细胞。“我们能够使用一种名为链球菌溶血素的细菌酶在细胞膜上钻一个约5纳米的微小孔洞。”Selvin说。这一宽度足以让荧光蛋白质通过，甚至是联合了抗体的蛋白质，以便寻找细胞内部的目标物体。之后，研究人员能利用尚未发表的方法在20分钟内修补这些孔洞。

另外，还有人担忧，这些探针会干扰靶蛋白的功能。而约翰斯·霍普金斯大学生物物理学家Jie Xiao则提出了一个不会损伤这些蛋白质的替代方案。

她的探针分子经过基因修饰，并非附着在目标分子上，它们被制作出来后，就立刻被一种酶劈开，并进入细胞膜的一个特定位置。这就意味着它们不再携带靶分子的位置信息，但却位于能对其进行精确计算的位置，并由此获得蛋白质产生的精确计数，同时，蛋白质本身能自由发挥功能。Xiao将该技术称为裂解共转化活化（CoTrAC）。

“量化活细胞的蛋白质水平非常重要。”Xiao解释道，“人们通常使用荧光指示出相对变化。”但其研究的基因调控蛋白质极少，很难用超分辨计数成像。此外，这些蛋白质的精确数字的细微变化也能判断细胞状态改变与否。

让背景暗下去

除了更明亮，另一个让探针脱颖而出的方法是降低背景亮度。德国波恩大学生物物理化学家Ulrich Kubitscheck表示，“细胞中也有扩散的背景。”非靶蛋白甚至本身就有天然、暗淡的荧光，这就造成了背景噪音。如果减少背景噪音，图像的清晰度就会提高。

因此，研究人员不断改进亮度策略。Kubitscheck实验室使用激光层照显微技术生产一个非常细的精确聚焦光束，该光束能从侧面穿过样本。“我们建造了一些下部和四周透明的玻璃室。”他说。通过从侧面而非顶部向样本照射光线，该团队照亮了一个200~300纳米厚的切片，并从下部对样本进行观察。科学家利用这种方法，看到RNA分子经过一种名为核膜孔的蛋白质络合物输出，进入细胞质。在这里，它们开始指挥蛋白质合成。


能进行激光层成像的显微镜已经商业化。具备专业知识的研究团队已经组成，并开始定制自己的显微镜。

而下一代选择性平面照明显微术被称为晶格光片显微镜，诞生自Betzig的实验室。项目合作者、珍妮莉娅法姆研究院细胞生物学家Zhe Liu说，该技术能产生300~500纳米厚的照明平面，其优点在于光点的结构。晶格能形成一个三维网格，照亮样本的连续剖面。

总之，显微镜技术在生物学发展历程中至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为关键技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史